¿Que es ROX y porque usarlo en qPCR?
¿Usar ROX o no usar ROX? Esa es una pregunta frecuente en trabajos de qPCR. ¿que es ROX?. ¿Porque y para que usarlo en qPCR?. Vamos a tratar de aclararlo en unas pocas líneas
¿Qué es ROX?
ROX, también conocido como carboxirodamina, es un tinte fluorescente inerte que se puede agregar a la mezcla maestra de qPCR. A diferencia de los tintes indicadores en qPCR (por ejemplo, SYBR Green), ROX se conoce como un tinte pasivo, ya que su señal de fluorescencia no se ve influenciada por las reacciones de PCR. En otras palabras, la señal fluorescente de ROX permanece estable durante todo el proceso de qPCR y no está relacionada con la cantidad de template en la reacción.
¿Por qué se emplea ROX en qPCR?
Dado que ROX es un tinte fluorescente pasivo, la razón principal por la que se utiliza en qPCR es para la normalización de la señal. Al normalizar la señal fluorescente, esto puede reducir la variabilidad entre muestras que técnicamente son réplicas.
Leves variaciones entre pocillos pueden afectar la señal fluorescente generada en qPCR.
Por ejemplo, las diferencias en los volúmenes de reacción debido a errores de pipeteo pueden sesgar los resultados. Además, los problemas asociados con el instrumento qPCR, como la óptica, también pueden influir en la señal fluorescente generada.
Puede pensar en el proceso de normalización al usar ROX como un concepto similar de por qué se usan genes de referencia durante los cálculos de expresión génica relativa, como el método Delta-Delta Ct. En lugar de controlar la cantidad de template en la muestra, ROX está normalizando los atributos de la mezcla de qPCR, como diferencias de volumen, presencia de burbujas, etc.
Para normalizar la señal fluorescente, la señal del tinte indicador se divide por la señal de ROX. El nuevo valor se conoce como valor informe normalizado (Rn).
Valor informe Normalizado (Rn) =Valor tinte Indicador/Valor tinte ROX |
Por lo general, en las gráficas de amplificación, el delta (Δ) Rn se representan en el eje “y” frente al número de ciclo en el eje “x”. El ΔRn es la diferencia entre el Rn de cada muestra experimental y el Rn de la línea de base. Por lo tanto, solo se trazarán los resultados que estén por encima de la línea de base / señal de fondo.
| ΔRn=Rn(cada muestra)- Rn(linea base) |
¿Es ROX esencial para qPCR?La respuesta corta es no. No es necesario que agregue ROX a su mezcla de qPCR. Sin embargo, agregarlo puede ayudar a reducir las variaciones de los valores fluorescentes en las muestras, lo que finalmente se reflejará en los resultados de la expresión génica. Otro punto importante es que el uso de ROX depende de la maquina qPCR que esté utilizando. Siempre verifique de antemano para ver si su qPCR es compatible con las mediciones de ROX. Algunas máquinas también “prefieren” reacciones con ROX alto, mientras que otras prefieren aquellas con ROX bajo. Asegúrese de configurar la máquina qPCR correctamente
Si decide utilizar qPCR en su mezcla de reacción, no olvide asegurarse de que la opción para registrar la fluorescencia ROX para el tinte pasivo esté habilitada. De lo contrario, la el equipo de qPCR no registrará ningún dato para este canal.
Del mismo modo, si decide no utilizar ROX, no habilite ningún canal que pueda medir el ROX. Simplemente, la máquina podría pensar que ROX está presente y registrar el ruido de fondo, lo que puede afectar sus resultados debido a una normalización incorrecta.